项目名称：首次建立非编码遗传物质的高通量功能性筛选技术平台

申报单位：北京大学

负责人：魏文胜 

项目简介：

立项依据

    基因的功能探索一直是生命科学研究的永恒主题。当人类基因组计划完成解码了全部基因组的遗传信息后，建立高效的高通量功能性筛选平台是非常重要的。近几年以CRISPR-Cas9为代表的基因组编辑技术让直接在高等生物体内进行基于基因敲除的功能筛选成为可能(Shalem, et al. Science 2014; Wang, et al. Science 2014; Koike-Yusa, et al. Nature Biotechnol 2014; Zhou, et al, Nature 2014)。然而，蛋白编码基因仅占3%不到的基因组，研究者发现越来越多的非编码元件在生命活动中发挥极其重要的作用，比如非编码RNA、特别是长非编码RNA（lncRNA）的异常与癌症等很多疾病的发生发展相关。遗憾的是在已经注释的超过两万多lncRNA中，绝大部分长非编码RNA的功能未知，如何实现这类基因组元件的功能筛选已经成为当前的研究热点。

对编码蛋白基因的敲除可以通过基因组编辑技术对目标区域实行单点切割、引入小片段插入或缺失（indels）以造成基因翻译读码框破坏，然而这一方法对于不依赖读码框的非编码元件作用有限。尽管有报道称用sgRNA文库通过饱和筛选研究单个或者少量基因的调控元件（Canver M.C. et al., Nature, 2015; Neville E. Sanjana et al., Science, 2016），但是在基因组水平上实现非编码元件的大规模筛选，依然缺乏有效的技术手段。因此，如何建立高效的非编码元件的高通量功能性筛选平台，一直是研究者普遍关注且急需解决的问题，对于调控元件的研究具有重大的科学意义。

主要创新点

    魏文胜课题组长期致力于基因组编辑和功能性基因组学的研究。在2011年TALEN技术兴起时，该课题组就潜心钻研于高效的基因组编辑技术的开发，并建立了高效的TALEN构建方法以及完成了TALE蛋白与DNA碱基结合的解码。当2013年CRISPR/Cas9技术平台进入人们的视线，魏文胜课题组迅速意识到其高效和易于构建的优势，并结合深度测序技术原创地建立了基于基因敲除的编码基因高通量功能性筛选技术平台，于2014年发表于《Nature》。

    对于占据基因组绝大部分且发挥重要调控功能的非编码区域，破坏基因读码框从而敲除基因的方法并不适用，已有的研究方法又具有效率低无法实现高通量等局限性，魏文胜课题组另寻角度，通过CRISPR系统的双sgRNA（pgRNA）引入基因组大片度删除直接删掉基因组中的非编码区域，从而建立非编码元件的敲除方法。他们通过慢病毒来介导pgRNA文库，并结合深度测序（deep-sequencing）实现了对长链非编码RNA的高通量功能性筛选。通过在多个癌细胞系中的筛选结果分析，他们找到了多个可以正向调控或负向调控癌细胞增殖的lncRNA，并通过多种方法证明了这些lncRNA的促癌或抑癌功能。这样的筛选方法可以用于研究在癌症发生发展过程中发挥重要作用的非编码元件，也可以通过靶向两个基因的pgRNA来研究两个基因同时发挥作用的基因对，对于寻找疾病的特征基因及寻找新的治疗靶点具有重要意义。

标志性成果的产生方式：

相关研究成果于2016年10月31日以“Genome-scale deletion screening of human long non-coding RNAs using a paired-guide RNA CRISPR?Cas9 library”为题在线发表于《Nature Biotechnology》杂志上（影响因子：43.113），这是首次实现长链非编码RNA的高通量筛选，将研究其在癌症发生发展中的作用推向新的阶段，并申请了发明专利。该成果得到了国内外媒体的广泛报道和普遍认可。

Shiyou Zhu*, Wei Li*, Jingze Liu, Chen-Hao Chen, Qi Liao, Ping Xu, Han Xu, Tengfei Xiao, Zhongzheng Cao, Jingyu Peng, Pengfei Yuan, Myles Brown, Xiaole Shirley Liu & Wensheng Wei (2016). Genome-scale deletion screening of human long non-coding RNAs using a paired-guide RNA CRISPR?Cas9 library. Nature Biotechnology, doi: 10.1038/nbt.3715.（北京大学为该论文的第一作者单位，魏文胜为本文的通讯作者）

http://www.nature.com/nbt/journal/vaop/ncurrent/full/nbt.3715.html